PolyShooter TransfectionReagent

　　Polymer Reagent For Transfecting Common Cell Lines

Catalog Number：P09110

01/LeapWal PolyShooter 轉(zhuǎn)染試劑 P09110產(chǎn)品概述

　　細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)以改變其基因型或表型的一種技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制基因功能的常規(guī)手段，廣泛應(yīng)用于基因功能研究、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等領(lǐng)域。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。其中化學(xué)介導(dǎo)方法因其兼具高效低毒、方便快捷等優(yōu)點，應(yīng)用廣泛。化學(xué)介導(dǎo)方法包括經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法以及多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法。

　　理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點。已有眾多文獻報道，脂質(zhì)體本身會參與細(xì)胞生理活動，影響基因表達(dá)，對研究數(shù)據(jù)產(chǎn)生一定程度的干擾。同時，脂質(zhì)體會對目的細(xì)胞造成細(xì)胞毒性，這種毒性是由其脂質(zhì)特性決定的。市面上多種商業(yè)化的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑要求細(xì)胞鋪板密度較高，以90%-95%為佳，這有助于減少陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性造成的影響。但是，如果研究的基因要求比較長的表達(dá)時間，例如細(xì)胞周期相關(guān)基因，或者細(xì)胞表面蛋白，又或者轉(zhuǎn)染后續(xù)需要進行繼續(xù)培養(yǎng)和功能研究，則不適合用脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑。目前眾多的研究者和生物公司將新一代轉(zhuǎn)染試劑的開發(fā)聚焦在非脂質(zhì)體的聚合物上，以尋找更高效低毒，同時對研究影響較小的轉(zhuǎn)染試劑。

　　LeapWal PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑，即PolyShooter Transfection Reagent是一種基于陽離子高分子聚合物的新型轉(zhuǎn)染試劑，適用于DNA、RNA的轉(zhuǎn)染。其原理為帶正電的高分子聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團形成帶正電的復(fù)合物后，與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過內(nèi)吞作用進入細(xì)胞，隨后在胞質(zhì)中釋放，實現(xiàn)外源核酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

　　LeapWal PolyShooter 轉(zhuǎn)染試劑 P09110對多種常見細(xì)胞具有高水平轉(zhuǎn)染效率，具有高效低毒、操作簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點。其*的配方使其可直接加入培養(yǎng)基中，血清的存在不會影響轉(zhuǎn)染效率，這樣可以減少去除血清對細(xì)胞的損傷。同時，轉(zhuǎn)染后不需要除去PolyShooterTransfectionReagent-核酸復(fù)合物或更換新鮮培養(yǎng)基，也可根據(jù)具體情況優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

冰袋（wetice）運輸。4℃保存，有效期6個月。-30℃至-10℃保存，有效期12個月，避免反復(fù)凍融。

04/產(chǎn)品特點

　　優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效率——針對廣泛類型的細(xì)胞，均表現(xiàn)出優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效率和高重組蛋白表達(dá)水平

　　細(xì)胞毒性低——作用溫和，能較好地實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率與低細(xì)胞毒性之間的平衡

　　操作簡單——在血清存在時亦具有可靠的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后無需去除復(fù)合物或更換新鮮培養(yǎng)基

　　高性價比——經(jīng)濟的價格，同時實現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)染效果

05/適用范圍

PolyShooter Transfection Reagent 采用陽離子高分子聚合物為主要成分，適用于DNA、RNA的轉(zhuǎn)染。

06/實驗流程概要

07/實驗步驟（以24孔板為例，其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一：轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)）

1:準(zhǔn)備待轉(zhuǎn)染細(xì)胞

　　貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，將消化后的細(xì)胞按照每孔0.3-2x10^5個細(xì)胞的量進行鋪板，使其在轉(zhuǎn)染時密度為50%-60%。

　　懸浮細(xì)胞：轉(zhuǎn)染當(dāng)天，配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物之前，在24孔板中進行細(xì)胞鋪板，每500µL生長培養(yǎng)基中加入2-5x10^5個細(xì)胞。

　　?細(xì)胞狀態(tài)會極大影響轉(zhuǎn)染效率，待轉(zhuǎn)染細(xì)胞應(yīng)處于良好生長狀態(tài)，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90%的細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染。

2:準(zhǔn)備PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物

　　（1）取1μg質(zhì)粒加入到1.5mL離心管中，加入2.5μL*PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒混合，室溫孵育3分鐘。

　　?*轉(zhuǎn)染試劑使用量受細(xì)胞類型及其他實驗條件影響，通常情況下，DNA（μg）和PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑（μL）的用量比例為1：2.5。建議初次使用時，可在1：2-1：5的范圍內(nèi)調(diào)整以優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果。

　　（2）往上述混合物中加入100μL無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基（與培養(yǎng)體系一致，且無血清無雙抗），輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

　　?PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物在室溫下4個小時內(nèi)保持穩(wěn)定。

3:細(xì)胞轉(zhuǎn)染

　　給細(xì)胞更換新鮮的預(yù)熱的*培養(yǎng)基500μL/孔，將上述100µLPolyShooter轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細(xì)胞，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。

　　?對于懸浮細(xì)胞系：轉(zhuǎn)染5小時后，可選擇加入PMA和/或PHA以提高CVM啟動子的活性并促進基因表達(dá)。對于Jurkat細(xì)胞，PHA和PMA的終濃度分別為1µg/mL和50ng/mL，可以提高CMV啟動子活性和基因表達(dá)。對于K562細(xì)胞，只加入PMA足以提高啟動子活性。

4.分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞

　　轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24-48小時后，可根據(jù)實際情況用熒光檢測法、WesternBlot、RT-PCR、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、報告基因等檢測轉(zhuǎn)染效果，或加入篩選藥物進行穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選。

08/注意事項

　　1.核酸質(zhì)量：想要獲得最高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細(xì)胞毒性，應(yīng)選用高純度、無菌、無污染、無內(nèi)毒素的優(yōu)質(zhì)核酸。質(zhì)粒中的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵，內(nèi)毒素會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率顯著下降，特別是對內(nèi)毒素敏感的細(xì)胞，例如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、造血細(xì)胞等。推薦使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進行質(zhì)粒提取，保證質(zhì)粒A260/A280比值為1.8-2.0。同時，需合理計算質(zhì)粒用量，轉(zhuǎn)染過量的質(zhì)粒可能會導(dǎo)致細(xì)胞毒性甚至死亡；

　　2.細(xì)胞質(zhì)量：細(xì)胞狀態(tài)會極大影響轉(zhuǎn)染效率，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90%的細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染；

　　3.細(xì)胞密度：建議細(xì)胞傳代后12-24h內(nèi)、細(xì)胞密度為50%-60%時進行轉(zhuǎn)染。不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗，對細(xì)胞密度的要求不盡相同。在進行不同核酸或不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染時，需要根據(jù)說明書再次優(yōu)化實驗條件。此外，在實驗過程中保證相同的接種條件，確保實驗數(shù)據(jù)的可重復(fù)性；

　　4.質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑使用比例：對于大多數(shù)細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染復(fù)合物中DNA(μg)與PolyShooter Transfection Reagent(μL)的比例在1：2至1：5之間，推薦比例為1:2.5。想要獲得轉(zhuǎn)染結(jié)果，需要對這一比例進行優(yōu)化，根據(jù)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞及質(zhì)粒選擇適合的轉(zhuǎn)染比例；

　　5.PolyShooter Transfection Reagent可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染，并且轉(zhuǎn)染前后不需要換培養(yǎng)基。但是，制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時要求用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑，因為血清會影響復(fù)合物的形成；

　　6.由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會抑制陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，因此有必要檢測特殊培養(yǎng)基與PolyShooter Transfection Reagent的相容性；

　　7.為了您的健康安全，請規(guī)范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗；

　　8.本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。

09/實驗案例分析

　　1:轉(zhuǎn)染前一天，將圖2所示9種狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于24孔板，使其在轉(zhuǎn)染時密度約為50%。

　　2:按照每孔計量，取1μgGFP質(zhì)粒加入到1.5mL離心管中，加入2.5μL PolyShooter Transfection Reagent與質(zhì)粒混合，室溫孵育3min后，往混合物中加入100μL無血清基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30min，形成PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

　　3:給細(xì)胞更換新鮮的預(yù)熱的*培養(yǎng)基500μL/孔，將上述100µLPolyShooter轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細(xì)胞，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。

　　4：轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達(dá)情況，并拍照記錄，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2:轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達(dá)情況

10/其他相關(guān)產(chǎn)品